Conception et Optimisation de Nanoparticules Dendrimériques pour le Traitement Photodynamique

La thérapie photodynamique (PDT) cible les petites tumeurs superficielles accessibles à la lumière. Elle repose sur l'utilisation d'un photosensibilisateur (PS), une molécule photoactivable qui, une fois administrée, s'accumule préférentiellement dans les tissus néoplasiques. L'irradiation lumineuse, en présence d'oxygène moléculaire, active le PS. Ce processus génère des espèces réactives de l'oxygène (ERO) cytotoxiques, principalement l'oxygène singulet (¹O₂). Cet oxygène singulet, extrêmement réactif, oxyde de nombreux substrats biologiques, conduisant à la mort des cellules cancéreuses. La capacité du PS à produire de l'oxygène singulet est un facteur déterminant de l'efficacité de la PDT. Le diagramme de Jablonski illustre les différents processus de transition énergétique impliqués, incluant la relaxation vibrationnelle, la conversion interne et la conversion inter-système, menant à l'émission de fluorescence ou à des processus non-radiatifs. La fluorescence du PS peut être utilisée à des fins diagnostiques, et son rendement quantique, défini par le rapport entre photons émis et absorbés, est un paramètre clé.

La PDT induit la mort cellulaire tumorale par différents mécanismes : apoptose, nécrose et autophagie. Les réactions de type I impliquent un transfert d'électrons ou d'hydrogène du PS à l'état triplet vers des substrats biologiques. Le PS et les substrats peuvent agir comme donneurs ou accepteurs d'électrons et d'hydrogène. La production de radicaux libres et d'ions radicalaires en est la conséquence. En présence d'oxygène, les formes oxydées du PS ou du substrat réagissent pour former des radicaux peroxydes, initiant une chaîne d'auto-oxydation. Les formes semi-réduites peuvent aussi interagir avec l'oxygène, générant des ERO tels que le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂), l'anion superoxyde (O₂⁻•) et le radical hydroxyle (•OH), de puissants oxydants de biomolécules comme le cholestérol et les chaînes latérales de certains acides aminés (tryptophane, histidine et méthionine). Une localisation du PS dans les lysosomes ou les membranes plasmiques favorise la nécrose, une mort cellulaire passive et non régulée caractérisée par une perte d'intégrité membranaire et une réaction inflammatoire subséquente, sans activation des voies des caspases.

L'efficacité antitumorale à long terme de la PDT résulte de la combinaison de trois mécanismes principaux. Premièrement, la PDT induit directement la mort des cellules tumorales via l'apoptose, la nécrose, ou l'autophagie. Deuxièmement, elle provoque des dommages à l'endothélium vasculaire, altérant la vascularisation tumorale et conduisant à une destruction indirecte par privation d'oxygène et de nutriments. Troisièmement, la PDT déclenche une forte réaction inflammatoire locale, pouvant engendrer une immunité systémique. La contribution relative de chaque mécanisme dépend du type de PS utilisé, de la dose de lumière (DLI), de l'oxygénation des tissus, et des paramètres d'irradiation. L’occlusion vasculaire, l’ischémie et la destruction cellulaire directe induisent une importante réaction inflammatoire caractérisée par un œdème tissulaire. Cette réaction, résultat d'un fort stress oxydant, est perçue par l’organisme comme un traumatisme, déclenchant une réponse immunitaire de protection. La dégradation photo-oxydative des membranes lipidiques libère des médiateurs de l'inflammation, notamment les métabolites de l'acide arachidonique, ainsi que de l'histamine et de la sérotonine par les vaisseaux endommagés. Ceci attire les cellules immunitaires (neutrophiles, mastocytes, macrophages) pour éliminer les débris cellulaires et initier une cascade inflammatoire avec recrutement massif de cellules immunitaires. Les antigènes tumoraux libérés sont phagocytés par les cellules présentatrices d'antigènes (macrophages, cellules dendritiques), contribuant à la mise en place d'une immunité adaptative.

Les photosensibilisateurs (PS) de première génération présentent des inconvénients limitant leur efficacité en thérapie photodynamique (PDT). Le document souligne le manque de solubilité en milieu aqueux, rendant leur administration systémique difficile et potentiellement douloureuse. De plus, leur sélectivité pour les cellules cancéreuses est souvent faible ou modérée, nécessitant des concentrations élevées en PS pour un traitement efficace. Ces concentrations élevées augmentent le risque d'effets secondaires importants. Les PS de deuxième génération, bien qu'apportant des améliorations, notamment en absorbant dans des longueurs d'onde rouges (spectre où les tissus biologiques sont plus transparents) et en présentant un rendement quantique en oxygène singulet plus élevé, conservent des limitations. Beaucoup souffrent d’une hydrophobie importante qui rend leur administration difficile et les fait s’agréger dans la circulation sanguine. Cette agrégation diminue leur efficacité in vivo et compromet la sélectivité tumorale, nécessitant des améliorations pour optimiser leur performance.

La Chlorine e6 (Ce6), un dérivé de la chlorophylle a, est un photosensibilisateur de deuxième génération étudié dans le document. Elle présente un intérêt pour la PDT grâce à son absorption dans le proche infrarouge (600-800 nm), une région spectrale où la pénétration dans les tissus biologiques est meilleure. Des études ont démontré que les molécules de type Chlorine sont capables de générer de l'oxygène singulet avec des rendements quantiques élevés. La Ce6 a montré une activité prometteuse lors d'essais cliniques initiaux en Russie. Le document mentionne également la Radachlorin®, un mélange aqueux contenant 80% de Ce6, 15% de Purpurin 5 et 5% de Chlorin p6. Développée en Russie, la Radachlorin® est approuvée pour le traitement de cancers de la peau en Russie et en Corée du Sud. Elle possède une toxicité à l'obscurité négligeable et une excrétion rapide (48h), minimisant les effets indésirables de photosensibilité cutanée. Des résultats encourageants ont été obtenus avec la Radachlorin®-PDT dans le traitement de tumeurs de l'utérus, gastro-intestinales, de la tête et du cou, des poumons, de la vessie et du foie.

Les propriétés physico-chimiques de la Ce6 influencent son comportement en milieu biologique. La modification du pH, notamment la neutralisation des charges des groupements carboxyles, modifie son caractère lipophile et ses interactions avec les structures biologiques. L'albumine, protéine majeure du plasma sanguin, est identifiée comme un transporteur principal de la Ce6 à pH 7.4, l'interaction étant stabilisée par les groupements carboxyles. Cependant, une baisse du pH déstabilise le complexe Ce6-albumine, augmentant simultanément la liaison de la Ce6 aux lipoprotéines de basse densité (LDL). La constante d'affinité de la Ce6 aux LDL est principalement gouvernée par son interaction avec les sites hydrophobes. Ces interactions, complexes et variables selon le pH, sont cruciales pour comprendre le devenir et l'efficacité de la Ce6 in vivo. Cette section souligne l'importance des propriétés de la Ce6, comme son hydrophobie et sa charge, sur sa distribution et son accumulation dans les cellules tumorales, influençant ainsi l'efficacité du traitement photodynamique.

Le devenir d'un photosensibilisateur (PS) après injection intraveineuse dépend de ses caractéristiques intrinsèques. Initialement, le PS se distribue entre les différents composants sanguins : il se désagrège ou se dissocie de son système de vectorisation s'il en possède un, se lie aux protéines plasmatiques et aux cellules sanguines. Ensuite, il interagit avec les parois vasculaires, un processus influencé par les caractéristiques spécifiques des vaisseaux de chaque organe. Le PS peut alors s'extravaser et diffuser dans le milieu extracellulaire du tissu ou de l'organe. L'incorporation du PS par les cellules tumorales, étape cruciale pour l'efficacité de la thérapie photodynamique, est déterminée par plusieurs facteurs : le bilan hydrophobie/hydrophilie, la charge et l'asymétrie de la structure du PS. Les PS hydrophiles, chargés ou polaires, sont internalisés par endocytose, tandis que les PS hydrophobes peuvent diffuser à travers les membranes cellulaires et se localiser dans les membranes des différents organites. Finalement, l'élimination du PS se fait via le drainage lymphatique et/ou les organes de rétention et de clairance, la vitesse d'élimination et le lieu d'élimination variant selon le PS utilisé. La structure du PS impacte sa rétention tumorale et ses voies d'élimination.

L'administration d'un médicament, y compris un photosensibilisateur, rencontre de nombreux obstacles in vivo : passage de barrières physiologiques (parois vasculaires, membranes cellulaires), métabolisation rapide, et sélectivité tumorale limitée. Cette faible sélectivité entraîne une accumulation dans les tissus sains, provoquant des effets secondaires. Pour contrer ces difficultés, la vectorisation des PS par des nanoparticules (NPs) est une approche prometteuse. Les NPs, particules de 1 à 1000 nm, transportent les PS, améliorant leur solubilité et protégeant contre la déactivation prématurée. Elles favorisent le ciblage tumoral par l'effet EPR (Enhanced Permeability and Retention), propre aux tumeurs solides en raison de leur vascularisation défaillante et leur mauvais drainage lymphatique. Le document mentionne différents types de nanocarriers biocompatibles: les nanoparticules lipidiques, les nanoparticules polymériques, les micelles, et les nanoparticules à base de silice. L'utilisation clinique de certaines NPs est déjà établie, comme le Doxil® (liposomal pégylé de doxorubicine) et l'Abraxane® (paclitaxel lié à l'albumine).

La vectorisation par NPs offre plusieurs avantages. Les NPs protègent les PS de la biodégradation et de l'excrétion prématurée, améliorant leur pharmacocinétique. La séquestration du PS dans la NP limite son accès aux enzymes, diminuant son clivage. Par exemple, la vectorisation du curcuma, sujet à l'oxydation, améliore sa stabilité et sa biodisponibilité. La taille des NPs influence leur extravasation et leur diffusion dans le tissu tumoral : des NPs de 2 à 10 nm (dendrimères, micelles) sont plus efficaces que les NPs plus grandes (~100 nm) telles que les liposomes ou les NPs à base d'albumine, pénétrant mieux les tissus. Le document cite l'exemple de la Ce6 conjuguée à des microsphères de polystyrène par l'équipe de T. Hasan (1991). Cette conjugaison a augmenté l'incorporation cellulaire de la Ce6 in vitro, potentialisant son effet phototoxique. Cependant, la génération d'oxygène singulet a été diminuée, suggérant que l'amélioration de l'efficacité phototoxique est due principalement à une meilleure accumulation intracellulaire. L'objectif est d'atteindre une accumulation tumorale sélective du PS, ce qui est amélioré par des approches de ciblage actif.

Les dendrimères, en raison de leur architecture tridimensionnelle hautement ramifiée, sont étudiés comme systèmes de transport de molécules en thérapie photodynamique (PDT). Leur petite taille (2-10 nm de diamètre), leur hydrosolubilité, leur structure avec des cavités internes et de nombreux groupements périphériques fonctionnalisables, en font des vecteurs prometteurs pour les photosensibilisateurs (PS). La vectorisation, qu'elle soit par greffage covalent ou encapsulation, permet la monomérisation et la solubilisation des PS, potentialisant leur activité photosensibilisatrice. De plus, leur petite taille permet de pallier deux inconvénients majeurs de la PDT : l'hydrophobicité de nombreux PS, rendant leur administration difficile, et leur accumulation non spécifique et limitée dans les tissus néoplasiques. L'utilisation de dendrimères permet de cibler passivement les tissus tumoraux grâce à l'effet EPR (Enhanced Permeability and Retention). Le document décrit quatre types de constructions dendrimériques utilisées en PDT, chacune présentant des avantages et des inconvénients.

Le document décrit différentes approches de fonctionnalisation des dendrimères pour la PDT. Une première approche utilise une porphyrine ou une phtalocyanine comme cœur, avec un dendrone greffé sur chaque unité pyrrole. Le groupe Kataoka a démontré la bonne efficacité photodynamique de ces nanoparticules excitables dans le rouge lointain, ce qui les rend appropriées pour des applications in vivo. Une deuxième construction consiste en l'encapsulation de photosensibilisateurs, comme la protoporphyrine IX (PpIX), dans le dendrimère, avec une libération progressive dans le milieu. Une dernière classe de structures est basée sur la liaison covalente de PS sur les groupements périphériques des dendrimères. L'exemple de l'acide 5-aminolévulinique (ALA), un précurseur de la PpIX, attaché à des dendrimères via une liaison ester clivable, a démontré une meilleure sélectivité tumorale in vivo. Cependant, le document note une diminution significative de la génération d'oxygène singulet lorsque de nombreux PS sont liés de manière covalente à un dendrimère, en raison d'effets de quenching.

L'équipe de Kataoka a développé des dendrimères à cœur de phtalocyanine encapsulés dans des micelles pour améliorer la vectorisation et la sélectivité in vivo. L'utilisation de PEG limite la reconnaissance par le système réticulo-endothélial (RES). Ces complexes micellaires polyioniques sphériques (PIC) montrent une meilleure incorporation cellulaire et une efficacité photodynamique accrue in vitro, avec une toxicité à l'obscurité réduite. In vivo, ils profitent de l'effet EPR et présentent une bonne stabilité. Les PIC ont démontré une accumulation sélective dans les lésions néovasculaires ophtalmiques. L'équipe a combiné les PIC avec la doxorubicine (DOX) pour l'internalisation photochimique (PCI), une approche qui permet le relargage du médicament dans un site cellulaire spécifique après la photoactivation du PS. Ils ont aussi remplacé la Zn-porphyrine par de la phtalocyanine (Pc) au cœur des dendrimères, améliorant leur activité PDT et limitant le photoblanchiment. Enfin, une construction dendritique à base de galactose conjuguée à la Pc a démontré une efficacité accrue contre le cancer de la vessie grâce au ciblage actif des protéines de surface GLUT 1 et galectine-1.

L'étude a porté sur la synthèse de trois nanoconstructions photoactivables à base de dendrimères poly(amidoamine) (PAMAM) de générations 4.5 et 5 (G4.5 et G5). La Chlorine e6 (Ce6), choisie pour ses propriétés photophysiques avantageuses, a été greffée de manière covalente via une liaison amide sur 25% des groupements périphériques des dendrimères. Chaque nanoparticule (NP) transporte ainsi 32 molécules de Ce6. Pour les dendrimères G4.5, un bras espaceur comportant deux extrémités amine a été utilisé pour la conjugaison de la Ce6 en périphérie, compte tenu de la présence de groupements carboxyles. Afin d'améliorer la solubilité en milieu aqueux et de réduire la reconnaissance par le système RES in vivo, des groupements de furtivité (méthyl-polyéthylène glycol, me-PEG) ont été greffés sur les dendrimères G4.5, résultant en la nanoconstruction G4.5-Ce6-PEG. La collaboration avec le Pr. Schneider (LRGP, UL) est mentionnée pour la synthèse des dendrimères.

Le greffage covalent de la Ce6 aux dendrimères PAMAM a eu un impact modéré sur ses propriétés photophysiques essentielles à la PDT. La génération d'oxygène singulet (¹O₂) et l'émission de fluorescence ont été légèrement affectées par la liaison covalente à la structure dendrimérique. Contrairement à d'autres études où le greffage diminuait significativement la génération d'¹O₂, dans cette étude, la modification est restée modérée. Cette observation est importante car la diminution du rendement quantique en oxygène singulet est un effet souvent constaté lors de la complexation de PS à des nanoparticules. Le fait que cette diminution soit modérée dans cette étude est un résultat favorable pour l'application de ces nanoconstructions en PDT.

L'étude a comparé les voies d'internalisation de la Ce6 libre et des nanoconstructions Ce6-dendrimères. Des expériences à 4°C, température inhibant les processus d'internalisation actifs, ont montré que la Ce6 libre pénètre les cellules par diffusion passive, tandis que les NPs à base de dendrimères utilisent un processus de transport actif. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques a révélé que les G4.5-Ce6 sont internalisés par endocytose médiée par la clathrine, tandis que les G4.5-Ce6-PEG, du fait de leur couche de PEG et de leur charge négative, sont internalisés par la voie des cavéoles. Malgré ces différences de voies d'internalisation, la localisation subcellulaire des nanoparticules Ce6-dendrimères, pégylées ou non, était très similaire, suggérant un comportement intracellulaire comparable. La localisation majoritairement lysosomale est notée, ouvrant la possibilité d'utiliser ces nanoparticules dans le cadre de l’internalisation photochimique (PCI).