Rôles de la protéine Damaged-DNA Binding 2 dans les cellules tumorales mammaires

Cette partie de la thèse se concentre sur l'analyse de l'expression de la protéine DDB2 dans les cellules tumorales mammaires. Deux lignées cellulaires sont utilisées : les MDA-MB231, caractérisées par une faible expression endogène de DDB2, et les MCF7, qui présentent une expression élevée. Pour moduler l'expression de DDB2, les chercheurs ont recours à des techniques de transfection et d'infection. Dans le cas des MDA-MB231, une surexpression stable de DDB2 est obtenue par transfection avec un vecteur d'expression pcDNA3(+) contenant l'ADNc codant pour DDB2 (MDA DDB2+). Un groupe contrôle (MDA DDB2-) est également inclus. Pour les cellules MCF7, une inhibition de l'expression de DDB2 est réalisée via une infection par des particules lentivirales contenant des shARN ciblant l'ARNm de DDB2 (MCF7 shDDB2). Un contrôle (MCF7 shCTL) est également mis en place. Le niveau d'expression de DDB2 est ensuite quantifié par RT-qPCR et Western blotting afin de valider l'efficacité des manipulations. Des études antérieures du laboratoire ont déjà établi un lien entre une expression réduite de DDB2 et une augmentation des capacités invasives des cellules tumorales mammaires. Cette partie vise à confirmer ces résultats et à explorer plus avant les mécanismes impliqués.

L'adhésion cellulaire étant un processus essentiel dans la progression tumorale, notamment durant l'invasion et la métastase, cette section analyse l'impact de DDB2 sur les capacités d'adhésion des cellules. Des tests d'adhésion classiques sont réalisés sur des surfaces de verre et de plastique. Les résultats démontrent que la surexpression de DDB2 dans les cellules MDA-MB231 et l'inhibition de son expression dans les cellules MCF7 ont une incidence significative sur l'adhérence cellulaire non spécifique. Plus spécifiquement, la surexpression de DDB2 semble diminuer l'adhérence des cellules sur ces surfaces, suggérant une modulation des interactions cellules-substrat. Ce résultat souligne un rôle potentiel de DDB2 dans le contrôle des propriétés d'adhésion des cellules tumorales mammaires. L'étude approfondit ces observations en explorant plus en détail les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces modifications de l'adhésion cellulaire, notamment en recherchant une relation avec la composition et la plasticité de la membrane plasmique.

Pour approfondir la compréhension de l'influence de DDB2 sur les propriétés cellulaires, cette partie de l'étude utilise la microscopie de force atomique (AFM), une technique permettant de mesurer les propriétés nanomécaniques des cellules. L'AFM est utilisée pour quantifier le module d'Young, indicateur de la rigidité cellulaire, ainsi que la force d'adhérence. Les expériences d'AFM révèlent que l'expression de DDB2 modifie significativement le module d'Young et la force d'adhérence, confirmant ainsi les résultats obtenus lors des tests d'adhésion. Une baisse de l'élasticité membranaire est notamment observée dans les cellules exprimant DDB2. L'analyse de la distribution du cytosquelette d'actine par coloration à la phalloïdine et microscopie à épifluorescence révèle une corrélation entre l'expression de DDB2 et une diminution du réseau d'actine corticale sous-membranaire. Cette observation suggère un lien entre l'expression de DDB2, l'organisation du cytosquelette d'actine, et les propriétés mécaniques de la membrane plasmique des cellules tumorales mammaires.

Pour identifier les mécanismes moléculaires par lesquels DDB2 influence l'adhésion cellulaire, une analyse par PCR-Array est menée. Cet outil permet l'étude simultanée de l'expression de nombreux gènes impliqués dans la régulation de l'adhésion. L'analyse révèle que l'expression de plusieurs gènes est modulée en fonction du niveau d'expression de DDB2. Toutefois, seuls les gènes codant pour TGFβ1, CTGF, et ICAM-1 présentent une modulation commune aux deux lignées cellulaires étudiées (MDA-MB231 et MCF7). Ces résultats confirment un impact significatif de DDB2 sur l'expression de gènes clés impliqués dans l'adhésion et suggèrent que les modifications observées dans les propriétés d'adhésion et nanomécaniques pourraient être liées à une régulation transcriptionnelle par DDB2 de ces gènes spécifiques. L'étude met en évidence l'importance d'explorer plus en détail le rôle de ces gènes cibles dans la régulation de l'adhésion cellulaire par DDB2.

Cette section explore la relation entre DDB2 et la voie de signalisation TGFβ1, un élément clé dans la progression du cancer du sein. Une PCR-Array, ciblant 84 gènes liés à l'adhésion cellulaire, est utilisée pour analyser l'impact de la modulation de l'expression de DDB2 sur le transcriptome. L'analyse révèle que l'expression de nombreux gènes est modifiée selon le niveau d'expression de DDB2. Cependant, trois gènes se distinguent par une modulation significative et commune aux deux lignées cellulaires étudiées (MDA-MB231 et MCF7) : TGFβ1, CTGF et ICAM-1. L'expression de TGFβ1 et CTGF est significativement diminuée dans les MDA-MB231 surexprimant DDB2, tandis qu'elle est augmentée dans les MCF7 où DDB2 est inhibée. L'expression d'ICAM-1 suit un schéma inverse. Ces résultats suggèrent un rôle important de DDB2 dans la régulation de l'expression de gènes cibles de la voie TGFβ1, ce qui souligne la complexité de l'interaction entre DDB2 et cette voie de signalisation majeure dans le développement du cancer du sein.

La présente section se concentre sur l'impact de DDB2 sur l'activité transcriptionnelle des Smads, protéines clés dans la transduction du signal TGFβ1. L'étude observe que DDB2 inhibe l'activité transcriptionnelle des Smads 2/3 activées par TGFβ1. Cependant, cette inhibition ne semble pas résulter d'une variation de l'expression de TGFβ1 ou de ses récepteurs de type I et II, car l'expression de ces derniers n'est pas affectée par la modulation de DDB2. Ce résultat suggère un mécanisme d'action plus direct de DDB2 sur la voie de signalisation TGFβ1, potentiellement par interaction directe avec les Smads ou d'autres composants de la cascade de signalisation. L'étude précise que le mécanisme moléculaire précis reste à élucider et justifie des investigations ultérieures pour comprendre comment DDB2 exerce son effet inhibiteur sur les Smads. La confirmation de la phosphorylation des Smads 2/3 en présence de DDB2 ainsi que l'étude de la fixation de DDB2 sur d'autres promoteurs de gènes cibles du TGFβ1 sont mentionnées comme perspectives.

Cette partie explore le rôle potentiel de l'activine A, un ligand du récepteur de type I Alk4, dans l'interaction entre DDB2 et la voie TGFβ1. L'expression de l'activine A et de la myostatine est étudiée par RT-PCR en temps réel dans les cellules où l'expression de DDB2 est modulée, en présence ou non de TGFβ1. La myostatine n'étant pas détectée, l'analyse se concentre sur l'activine A. Les résultats montrent que l'expression de l'activine A est inhibée dans les MDA-MB231 surexprimant DDB2, et augmentée dans les MCF7 où DDB2 est inhibée. Cette modulation est plus prononcée en présence de TGFβ1. L'utilisation d'un inhibiteur de l'activine A (follistatine) suggère une implication de l'activine A dans la suractivation de l'élément CAGA (un élément de réponse aux Smads) en présence de TGFβ1 et Alk4, particulièrement dans les cellules exprimant faiblement DDB2. Ces résultats laissent entrevoir que l'activine A pourrait être un nouveau gène cible de la voie TGFβ1 avec lequel DDB2 interagit, ouvrant des perspectives d'investigation sur les mécanismes moléculaires de cette interaction.

Cette partie de l'étude examine l'impact de DDB2 sur les propriétés d'adhésion des cellules tumorales mammaires. Des tests d'adhésion sur des surfaces de verre et de plastique montrent que la surexpression de DDB2 réduit significativement l'adhérence cellulaire non spécifique. Cette diminution de l'adhésion n'est pas observée lors de l'adhésion spécifique à des protéines de la matrice extracellulaire comme les collagènes I et IV. Les résultats suggèrent des modifications de la composition membranaire et/ou des propriétés nanomécaniques comme cause potentielle de cette altération de l'adhésion non spécifique. L'étude explore plus en détail les propriétés nanomécaniques via la microscopie de force atomique (AFM).

L'étude utilise la microscopie de force atomique (AFM) pour mesurer les propriétés nanomécaniques des cellules tumorales mammaires en fonction de l'expression de DDB2. L'AFM permet de quantifier le module d'Young (rigidité) et la force d'adhérence des cellules. Les résultats montrent que les cellules exprimant DDB2 présentent une diminution de leur rigidité et de leur force d'adhérence à la pointe de l'appareil. Ces changements sont corrélés à une modification de l'organisation du cytosquelette d'actine. En effet, les cellules exprimant DDB2 montrent une diminution du réseau d'actine corticale sous-membranaire observée par microscopie à épifluorescence après coloration à la phalloïdine. Cette altération du cytosquelette d'actine pourrait expliquer la modification de l'élasticité membranaire observée. L'AFM se révèle donc un outil précieux pour l'analyse des changements cellulaires au cours de la tumorigenèse.

Pour explorer les mécanismes moléculaires responsables des changements d'adhésion observés, une analyse par PCR-Array est effectuée sur les gènes impliqués dans l'adhésion cellulaire. Cette analyse met en lumière la modulation de l'expression de plusieurs gènes selon le niveau d'expression de DDB2. Cependant, seuls les gènes codant pour TGFβ1, CTGF et ICAM-1 montrent une modulation commune aux deux lignées cellulaires étudiées (MDA-MB231 et MCF7). L'étude suit l'apparition de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) au cours du temps de culture des cellules MCF7 (shCTL et shDDB2). À des passages précoces, aucune différence n'est observée entre les cellules contrôles (shCTL) et celles avec l'expression de DDB2 inhibée (shDDB2). Cependant, après 15 passages, les cellules MCF7 shDDB2 présentent une morphologie modifiée (filopodes), une diminution significative de l'expression de la cadhérine E et une augmentation de l'expression de Snail, confirmant l'apparition de la TEM, un processus lié à l'augmentation des capacités invasives. Cette étude suggère donc que DDB2 joue un rôle précoce dans la progression métastatique en influençant les propriétés d'adhésion cellulaire et en retardant la TEM.

Cette section explore le mécanisme par lequel DDB2 pourrait agir comme un co-répresseur des Smads, des protéines effectrices clés de la voie de signalisation TGFβ1. L'étude observe une inhibition de l'activité transcriptionnelle des Smads 2/3 par DDB2, mais cette inhibition n'est pas liée à une variation de l'expression de TGFβ1 lui-même, ni de ses récepteurs. L'hypothèse d'une interaction directe de DDB2 avec les Smads ou d'autres composants de la voie de signalisation est envisagée, nécessitant des investigations complémentaires. L'étude mentionne la nécessité de confirmer des résultats préliminaires, notamment l'état de phosphorylation des Smads 2/3 en présence de DDB2 et le maintien de la liaison des Smads 2/3 sur le promoteur du gène PAI-1 malgré la présence de DDB2. L'analyse de la fixation de DDB2 sur d'autres promoteurs de gènes cibles du TGFβ1 est également suggérée pour déterminer la spécificité de cette interaction.

Cette partie explore un mécanisme potentiel impliquant l'activine A dans l'interaction entre DDB2 et la voie TGFβ1. L'expression de l'activine A est analysée dans les cellules où l'expression de DDB2 est modulée. Les résultats montrent que l'expression de l'activine A est inhibée par la présence de DDB2, et cet effet est accentué en présence de TGFβ1. L'utilisation de la follistatine, un inhibiteur de l'activine A, révèle que cette dernière contribue à la suractivation de l'élément CAGA (un élément de réponse aux Smads) en présence de TGFβ1 et du récepteur Alk4, notamment dans les cellules exprimant faiblement DDB2. L'activine A est donc identifiée comme candidat gène cible de la voie TGFβ1, et son interaction avec DDB2 suggère une implication complexe de cette dernière dans la régulation de la voie TGFβ1. Des analyses futures sont nécessaires pour identifier les sites de fixation des Smads sur le promoteur du gène de l'activine A.

Les résultats de cette étude ont des implications cliniques significatives, en particulier concernant la compréhension de la progression tumorale et le développement de nouveaux biomarqueurs. L'étude souligne que DDB2 pourrait constituer un nouveau biomarqueur de la progression métastatique du cancer du sein, en raison de son impact sur l'adhésion cellulaire, les propriétés nanomécaniques, et la voie TGFβ1. L'Institut National du Cancer (INCa) a défini la compréhension des mécanismes moléculaires régissant les cancers comme une priorité de recherche. Cette recherche contribue à cette priorité en apportant de nouveaux éléments sur le rôle de DDB2 dans la tumorigenèse mammaire, notamment en montrant son implication dans la régulation de la prolifération, de l'invasion, et de la sensibilité aux traitements anticancéreux. Des recherches futures viseront à clarifier le mécanisme moléculaire précis par lequel DDB2 interagit avec la voie TGFβ1 et à confirmer certaines observations préliminaires.