Étude de la dissémination des cellules tumorales dans les carcinomes épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures

L'étude porte sur la détection des cellules tumorales circulantes (CTC) dans les carcinomes épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures (CEVADS), un domaine de recherche encore peu exploré. Malgré des traitements agressifs, le pronostic des CEVADS reste médiocre, avec un taux de survie à 5 ans de 40 à 50%. La détection des CTCs, considérée comme une « biopsie liquide », offre un potentiel significatif pour améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer, notamment en termes de diagnostic, de stratégie thérapeutique et de surveillance. L'étude vise à détecter la présence de CTCs aux stades III et IV des CEVADS et à évaluer leur taux de variation dans la circulation sanguine avant, pendant et après un acte chirurgical. Un second objectif est de comparer les résultats obtenus par RT-PCR et par CellSearch®, un système automatisé approuvé par la FDA pour la détection des CTCs dans le cancer du sein métastatique. L'analyse se concentre sur 9 molécules exprimées par ces cancers : BphB4, Elf3, CEA, CK18, CK19, EpCAM, EGFR, PVA, SCCA, et GAPDH (gène de référence). La recherche des CTCs a été bien étudiée pour les cancers du sein, de la prostate, du côlon et du poumon, mais peu dans les CEVADS. Cette étude vise à combler cette lacune et à identifier des marqueurs spécifiques pour les CEVADS.

Deux méthodes principales sont utilisées pour la détection des CTCs : la RT-PCR en temps réel et le système CellSearch®. La RT-PCR, utilisant le SYBR Green comme agent intercalant fluorescent, permet l'amplification et la quantification d'un fragment d'ADN spécifique. Chaque cycle de PCR comprend trois phases : dénaturation, hybridation des amorces et élongation. Le système CellSearch®, quant à lui, est un automate qui sélectionne et marque les cellules tumorales circulantes. Il utilise un ferrofluide contenant des anticorps anti-EpCAM pour la sélection, puis différents marquages fluorescents (anticorps anti-cytokératines CK8, 18, 19 et anti-CD45) pour différencier les cellules d'intérêt des autres cellules sanguines. Un canal supplémentaire peut être utilisé pour révéler le marquage additionnel pour l'anticorps anti-EGFR. L'évolution de chaque marqueur entre les trois temps (préopératoire, peropératoire et postopératoire) est étudiée par un modèle linéaire mixte pour tenir compte de la répétition des mesures chez une même patiente. Des analyses post-hoc et une correction de Bonferroni sont effectuées pour comparer les temps deux à deux et corriger l'inflation du risque alpha. Les analyses sont réalisées sur les valeurs brutes, les valeurs transformées par logarithme et les valeurs rangées selon la méthode de Conover.

L'analyse individuelle des résultats apporte des informations sur le comportement des cellules tumorales lors de leur migration. Le profil d'expression des marqueurs dans la tumeur primitive est superposable à celui observé dans le ganglion métastatique pour tous les patients inclus dans l'étude, suggérant une conservation des caractéristiques des cellules tumorales pendant leur migration. Cependant, il est connu que le phénotype des cellules tumorales peut varier en fonction de leur localisation. L'étude a également mis en évidence une surexpression de certains marqueurs (PVA et desmogleine 3) dans les carcinomes épidermoïdes des VADS, soulignant la fiabilité et la sensibilité de ces marqueurs. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour confirmer ces résultats préliminaires, notamment pour tester la capacité de ces marqueurs à détecter des micrométastases et définir une valeur seuil pour un résultat positif. L’EGFR, surexprimé dans plus de 90% des HNSCC, montre une discordance importante entre la tumeur primaire et les CTCs dans cette étude. L'hypothèse d'une transition mésenchymateuse-épithéliale (MET) est évoquée, nécessitant une confirmation. Le nombre élevé de CTCs postopératoires pourrait être dû à la ré-entrée dans la circulation de cellules tumorales disséminées dans les tissus mésenchymateux.

L'identification de marqueurs moléculaires fiables est cruciale pour le diagnostic précoce des métastases ganglionnaires dans les carcinomes épidermoïdes des voies aérodigestives supérieures (CEVADS). Cette section détaille le choix des marqueurs étudiés et la justification de leur sélection. L'étude a retenu six marqueurs potentiellement efficaces pour le diagnostic : S, WS, p63, EGFR, CK17, et CK19. Le choix de ces marqueurs s'appuie sur des recherches bibliographiques qui ont mis en évidence leur potentiel dans la détection des métastases ganglionnaires cervicales. Le document souligne la complexité du choix des marqueurs, les CEVADS partageant de nombreux marqueurs communs avec d'autres types cellulaires. L'étude précise que la recherche de marqueurs spécifiques et reconnus par tous pour les CEVADS est un défi important. La préparation des échantillons est également détaillée, incluant la décongélation des fragments de ganglions métastatiques et sains, leur homogénéisation dans un réactif spécifique (LynoHage, Sysmex) pour stabiliser les molécules d'ARN et les protéger de l'activité ribonucléase, puis une centrifugation pour éliminer les inhibiteurs de la PCR. L'analyse porte sur l'expression de ces marqueurs, visant à déterminer leur sensibilité et spécificité dans la détection de l'envahissement ganglionnaire.

Deux techniques principales sont utilisées pour l’analyse de l’expression des marqueurs moléculaires dans les ganglions lymphatiques : la PCR quantitative en temps réel (RT-PCR) et la technique OSNA®. La RT-PCR utilise le SYBR Green, un agent intercalant fluorescent qui se lie à l'ADN double brin et émet une fluorescence mesurée à la fin de chaque cycle d'amplification. L'augmentation du signal fluorescent est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons générés. L'OSNA®, une technique plus rapide, est comparée à la RT-PCR. L'étude mentionne que la CK19 n'apparaît pas comme le marqueur le plus performant dans cette étude, mais la technique OSNA représente une avancée technique significative en raison de son temps d'analyse réduit. L'étude évoque la possibilité d'utiliser d'autres marqueurs que la CK19 avec la technologie OSNA, comme S ou le PVA. L'analyse de l'expression des marqueurs est effectuée pour déterminer leur utilité dans le diagnostic de l’envahissement ganglionnaire. Le document souligne l'intérêt du S et du WS, confirmant leur utilité comme marqueurs dans l'analyse moléculaire.

L'analyse de l'expression des marqueurs moléculaires vise à identifier les marqueurs les plus performants pour le diagnostic de métastases ganglionnaires cervicales. L'étude souligne que l'analyse individuelle des résultats est intéressante car elle apporte des renseignements sur le comportement des cellules tumorales lors de leur migration. Le profil d'expression des marqueurs dans la tumeur primitive est souvent superposable à celui observé dans le ganglion métastatique, suggérant une conservation des caractéristiques cellulaires pendant la migration. Cependant, il est reconnu que le phénotype cellulaire peut varier en fonction du microenvironnement. L'étude mentionne une surexpression constante de PVA (ou desmogleine 3) à un niveau élevé dans le tissu tumoral et faible dans le tissu sain, mettant en avant la fiabilité et la sensibilité de ce marqueur. Pour confirmer les résultats préliminaires, le document souligne le besoin d'investigations supplémentaires pour tester la capacité de ces marqueurs à détecter des micrométastases et déterminer une valeur seuil de positivité. L'expression de l'EGFR et sa relation avec l'expression du p63 sont également analysées, l'étude mentionnant une relation directe entre ces deux marqueurs.

Cette partie de l'étude explore l'hypothèse que l'acte chirurgical joue un rôle significatif dans la libération de cellules tumorales circulantes (CTCs) dans la circulation sanguine. L'objectif est d'évaluer l'évolution du nombre de CTCs avant, pendant et après l'intervention chirurgicale. L'étude utilise le système CellSearch®, un système automatisé approuvé par la FDA pour la détection des CTCs, permettant la quantification des CTCs à différents moments : préopératoire (jour -1), peropératoire et postopératoire (jour +7). Le protocole inclut l’utilisation d’un kit EGFR pour la détection de l'Epidermal Growth Factor Receptor sur les CTCs. L'étude note une diminution importante du nombre de CTCs au moment de la chirurgie, suivie d'une augmentation significative postopératoire. Ce constat suggère que l'acte chirurgical lui-même pourrait contribuer à la dissémination des cellules tumorales. L’absence d’expression de l’EGFR sur toutes les CTCs détectées, malgré sa surexpression dans plus de 90% des HNSCC, est un résultat inattendu et nécessite une analyse plus approfondie.

L'étude analyse l'évolution de différents marqueurs tumoraux dans le sang des patients avant, pendant et après l'intervention chirurgicale. Une analyse statistique utilisant un modèle linéaire mixte est employée pour tenir compte de la répétition des mesures chez les mêmes patients. L'effet fixe est le temps (préopératoire, peropératoire, postopératoire), et l'effet aléatoire est la patiente. Des analyses post-hoc sont réalisées pour comparer les différents temps, et une correction de Bonferroni est appliquée pour contrôler l'inflation du risque alpha. Les analyses sont effectuées sur les valeurs brutes, les valeurs logarithmiques transformées et les valeurs rangées (méthode de Conover). Cette analyse statistique permet de déterminer si les variations observées dans les niveaux des marqueurs sont statistiquement significatives. L'étude identifie des marqueurs dont le taux de variation est spécifique aux CEVADS, soulignant leur potentiel pour des investigations futures. L'augmentation significative de certains marqueurs postopératoires, par rapport à leur niveau de base, pourrait refléter le phénotype des cellules tumorales libérées lors du geste chirurgical.

Les résultats obtenus suggèrent que l'acte chirurgical pourrait libérer des cellules tumorales dans la circulation sanguine, contribuant à la dissémination tumorale. L’augmentation postopératoire du nombre de CTCs pourrait prédire une récidive. L'étude souligne que la détection simultanée de plusieurs marqueurs peut améliorer la sensibilité du diagnostic et la prédiction du risque de récidive, comme démontré dans des études concernant le cancer de l'œsophage, du poumon ou du sein. L'absence d'expression d'EGFR sur les CTCs détectées dans cette étude, malgré sa fréquence élevée dans les tumeurs primaires de CEVADS, est discutée. L'hypothèse d'une transition mésenchymateuse-épithéliale (MET) est formulée comme une explication possible. Les résultats obtenus par RT-PCR sont considérés comme prometteurs, même si une optimisation des protocoles est nécessaire pour améliorer la sensibilité de détection et développer un arbre décisionnel plus précis pour l'interprétation des résultats. L'étude suggère que l'analyse des CTCs pourrait fournir des informations importantes sur la biologie tumorale et la réponse au traitement.

Cette étude utilise deux méthodes principales pour la détection et la quantification des cellules tumorales circulantes (CTCs) : la RT-PCR en temps réel et le système CellSearch®. La RT-PCR, utilisant le SYBR Green, permet l’amplification et la mesure de l'expression de marqueurs spécifiques. Le système CellSearch®, un automate approuvé par la FDA pour le cancer du sein métastatique, sélectionne et marque les CTCs en utilisant des anticorps anti-EpCAM et un panel d'anticorps anti-cytokératines (CK8, 18, 19) et anti-CD45, permettant leur identification et leur comptage. L'analyse de l'évolution du nombre de CTCs et de l’expression des marqueurs est effectuée sur des échantillons prélevés à trois moments : préopératoire, peropératoire et postopératoire. Pour analyser ces données, l'étude utilise un modèle linéaire mixte pour prendre en compte la répétition des mesures chez chaque patiente. L’effet fixe est le temps, et l’effet aléatoire est la patiente. Des analyses post-hoc sont réalisées pour comparer les trois temps entre eux, avec une correction de Bonferroni pour le risque alpha. Les analyses sont effectuées sur les valeurs brutes, les valeurs transformées par logarithme et les valeurs rangées selon la méthode de Conover.

Les résultats préliminaires de l'étude montrent des variations significatives dans l'expression de certains marqueurs chez les patients atteints de CEVADS. L’analyse par RT-PCR révèle des résultats prometteurs, mais une optimisation des protocoles est nécessaire pour améliorer la sensibilité de détection. L'établissement d'un arbre décisionnel, basé sur le nombre et la positivité des marqueurs détectés, est envisagé pour faciliter l'interprétation des résultats. L'étude se réfère à des études similaires menées sur d'autres types de cancers (poumon, œsophage, sein) utilisant la RT-PCR et ayant déjà établi des arbres décisionnels. L'étude mentionne l'exemple de la combinaison de transcrits d'EEM de CEA et de Survivin par RT-PCR, démontrant un potentiel de prédiction du risque de développement de micrométastases dans le cancer de l'œsophage. D’autres exemples sont cités pour le cancer du poumon (TSA-9, pre-proGRP, KRT-19) et le cancer du sein (Survivin, hTERT, hMAM). L'objectif est d'atteindre une meilleure sensibilité de détection pour un diagnostic plus précis et fiable des CEVADS.

L'interprétation globale des résultats souligne l'augmentation significative de certains marqueurs postopératoires, probablement reflétant le phénotype cellulaire des cellules tumorales libérées lors de la chirurgie. Cependant, cette approche globale pourrait masquer la présence de sous-populations tumorales différentes, ce qui pourrait être exploré par une analyse individuelle des courbes d'expression des marqueurs. La significativité de ces marqueurs est discutée en termes d'activité biologique. La recherche de marqueurs spécifiques pour les CEVADS est un défi, car ces cancers partagent des marqueurs communs avec d'autres types cellulaires. Les premiers résultats obtenus par RT-PCR et CellSearch sont jugés spécifiques et sensibles pour les CEVADS, ouvrant la voie à de futures investigations. L'étude est présentée comme une étude préliminaire de faisabilité, soulignant la nécessité d'investigations complémentaires pour confirmer ces résultats et optimiser les méthodes de détection.