Évaluation de l'adhésion et de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses

L'augmentation des maladies vasculaires humaines, telles que l'athérosclérose et l'hypertension, souligne le besoin urgent de nouvelles thérapies. La thérapie cellulaire, un domaine où l'ingénierie tissulaire et la médecine régénérative convergent, offre des traitements prometteurs grâce au potentiel de régénération des cellules souches. Ces cellules, avec leur capacité de différenciation multilineage, sont considérées comme des sources cellulaires prometteuses pour la médecine régénérative, leur différenciation étant influencée par des facteurs environnementaux tels que la matrice extracellulaire, la tension d'oxygène et les forces mécaniques. Cette revue se concentre sur les sources de cellules souches humaines et leurs applications dans la régénération vasculaire, notamment les stratégies de différenciation en cellules musculaires lisses et cellules endothéliales matures et fonctionnelles. L'ingénierie tissulaire in vitro a longtemps présenté des défis, mais les approches de thérapie tissulaire et cellulaire ont rendu cette approche plus réaliste. Des problèmes fondamentaux persistent cependant, tels que la standardisation des protocoles de culture et de différenciation cellulaire, avant que cette technologie ne devienne une pratique courante. La recherche actuelle se concentre sur l'utilisation de sources cellulaires alternatives, et cette revue souligne le rôle crucial de l'origine des cellules souches dans la médecine régénérative vasculaire. Divers protocoles de différenciation des cellules souches ont été décrits, notamment les stratégies utilisées pour la différenciation en cellules musculaires lisses et cellules endothéliales matures et fonctionnelles, et leurs applications dans la médecine régénérative vasculaire.

L'étude met en avant l'intérêt des cellules souches mésenchymateuses (CSM) pour la régénération tissulaire, notamment vasculaire. La moelle osseuse est une source majeure de CSM, mais son utilisation est limitée par des risques de contamination virale et une diminution de la capacité de prolifération et de différenciation avec l'âge. La gelée de Wharton du cordon ombilical humain apparaît comme une alternative intéressante, étant une source abondante, facilement accessible et non-invasive. Les CSM de la gelée de Wharton (WJ-MSCs) possèdent une grande capacité de prolifération et un potentiel de différenciation multilineage, notamment vers des cellules neuronales, cardiomyocytes, cellules musculaires lisses, cellules productrices d'insuline, cellules cartilagineuses et ostéocytes. Plusieurs équipes étudient la faisabilité d'utiliser les WJ-MSCs humaines comme cellules progénitrices endothéliales pour créer des vaisseaux sanguins humains de petit diamètre. La différenciation des MSCs est fortement dépendante de l'environnement mécanique du substrat et du milieu de culture (facteurs de croissance, contenu en sérum). Le sérum de veau foetal (FBS) est un composant majeur du milieu de culture, contenant de nombreux facteurs influençant l'adhésion et la différenciation des CSM. Malgré la variabilité de la composition du FBS, l'impact de sa concentration optimale sur la culture et la différenciation des MSCs a été étudié. La recherche d’alternatives aux CSM de moelle osseuse est justifiée par la difficulté d’obtenir des cellules en nombre suffisant, et par la diminution de leur capacité proliférative et de différenciation en fonction de l’âge et de l’état de santé du donneur. L’isolement des cellules musculaires lisses et endothéliales endommage le site donneur et peut être limité par l’état de santé et l’âge du patient. De plus, l’amplification des cellules matures diminue leur fonction et implique une dédifférenciation cellulaire.

Le projet de recherche a bénéficié de collaborations cruciales pour sa réussite. Une collaboration avec des chimistes strasbourgeois, Dr. Fouzia Boulmedais (CR, CNRS, ICS) et Dr. Benoît Frish (DR, CNRS, IGBMC), a permis la modification des polymères utilisés. Une collaboration additionnelle avec l’équipe BioS 4691 de la Faculté d’odontologie de l’université de Reims Champagne-Ardenne a servi à tester la biocompatibilité des polymères pendant 6 mois de la thèse. L’Unité Inserm UI 961 a permis la réalisation des manipulations de biologie moléculaire sous la direction du Dr. Nathalie Mercier. La méthode d'explants a été utilisée pour isoler les CSM de la gelée de Wharton. Après le rinçage dans une solution HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution), les cordons ombilicaux sont conservés à 4°C dans une solution saline stérile avant traitement. Les vaisseaux du cordon ombilical sont retirés manuellement, et la gelée de Wharton est découpée en petits morceaux (explants) pour la culture. Le milieu de culture comprend de l’alpha-MEM (Lonza), du FBS décomplémenté (Sigma) et des antibiotiques. Les WJ-MSCs sont utilisées au quatrième passage et ensemencées à une densité de 3000 cellules/cm² sur un film (PSS/PAH)4 ou des lames de verre (témoin) dans un milieu α-MEM et incubées à 37°C en normoxie (21% d’O2, 5% de CO2). Le CHU de Nancy a fourni les cordons ombilicaux après consentement éclairé.

L'étude de la différenciation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) nécessite le choix de biomatériaux appropriés. Le chitosane (CHI) et l'acide hyaluronique (HA), ainsi que leurs dérivés fonctionnalisés (CHI-SH, CHI-Alcyne, HA-maléimide, HA-N3, HA-Thiopyridone), sont étudiés pour leur capacité à supporter la croissance et la différenciation cellulaire. Ces polymères, modifiés par greffage de groupements thiols ou alcynes, permettent une post-réticulation sans agent chimique. Le choix de ces biomatériaux est motivé par leurs propriétés biocompatibles. Les films multicouches de polyélectrolytes, notamment ceux constitués de polystyrène sulfonate (PSS) et de polyallylamine chlorhydrate (PAH), sont également évalués. Ces films, connus pour leurs propriétés anti-inflammatoires et antithrombogéniques, servent de substrat pour la culture des CSM. La comparaison entre ces films de polyélectrolytes synthétiques et des biomatériaux naturels comme le CHI/HA est effectuée pour optimiser les conditions de différenciation cellulaire. L’adhésion et la prolifération des cellules sur les films de polyélectrolytes sont généralement bonnes, en partie grâce à la présence de groupes sulfonates. Avant l’ensemencement des WJ-MSCs sur ces supports, leur phénotype immunitaire a été examiné. Aucun marqueur unique n’a été identifié pour définir de manière prédictive les CSM. Les CSM en culture sont traditionnellement décrites comme étant négatives pour les marqueurs hématopoïétiques (CD45, CD14, CD34) et les marqueurs endothéliaux (CD31, CD144). En revanche, elles expriment CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 et CD146 et l'expression de HLA de classe I mais l'absence de HLA de classe II et de molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86. Les cellules utilisées dans cette étude répondent à ce profil.

L'optimisation des conditions de culture in vitro est essentielle pour favoriser la différenciation des CSM en cellules endothéliales. L'étude explore l'influence de différents paramètres sur le processus de différenciation. Parmi ces facteurs figure la concentration de sérum fœtal bovin (FBS) dans le milieu de culture. Le FBS, bien que couramment utilisé, peut entraîner des réactions immunologiques chez les patients, motivant la recherche de milieux sans sérum. L’étude examine également l’effet du pourcentage de SVF (stromal vascular fraction) dans le milieu de culture (EGM-2). Une comparaison est faite entre des cultures avec 5% et 2% de SVF. L’influence de la nature du support, en utilisant notamment des films multicouches de polyélectrolytes (PSS/PAH) ainsi que des supports contrôle, est examinée. La microscopie électronique à balayage (SEM) a révélé que les cellules cultivées sur CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio présentaient une morphologie de type fibroblastique, caractéristique des CSM et identique à celle des témoins. Sur CHI-SH-HA-Mal et CHI-Alc-HA-N3, seuls des débris cellulaires ont été observés. Ces observations confirment les résultats de la coloration du cytosquelette. Les polymères CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio ont été sélectionnés pour leur meilleure biocompatibilité. Sur ces échafaudages, les WJ-MSCs adhèrent et prolifèrent de manière mono-couche en conservant leur morphologie de type fibroblastique. Ces polymères ont été sélectionnés pour affiner le protocole de différenciation endothéliale, en suivant le comportement cellulaire dans un milieu de différenciation.

L'évaluation de la biocompatibilité des différents polymères est une étape cruciale de la recherche. Le chitosane (CHI) et l'acide hyaluronique (HA), ainsi que leurs dérivés fonctionnalisés (CHI-SH, CHI-Alcyne, HA-maléimide, HA-Thio, HA-N3), sont testés. La microscopie électronique à balayage (SEM) a été utilisée pour observer la morphologie des cellules souches mésenchymateuses (CSM) cultivées sur ces différents supports. Les résultats montrent une bonne biocompatibilité pour les polymères CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio, les CSM conservant une morphologie fibroblastique caractéristique. En revanche, CHI-SH-HA-Mal et CHI-Alc-HA-N3 ont montré une faible biocompatibilité, avec seulement des débris cellulaires observés. Ces résultats, confirmés par des analyses de coloration du cytosquelette, guident le choix des polymères pour la suite des expérimentations. Les polymères CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio, étant les plus biocompatibles, ont été retenus pour l'optimisation du protocole de différenciation endothéliale. Une étude cinétique a suivi le comportement des cellules dans le milieu de différenciation afin de déterminer un protocole optimal pour favoriser la croissance cellulaire et prévenir le détachement prématuré des cellules endothéliales-like après deux semaines de culture, en particulier en jouant sur le taux de sérum dans le milieu de culture. Les films multicouches de polyélectrolytes (PSS/PAH), avec leurs propriétés anti-inflammatoires et antithrombogéniques, ont également été testés.

L’évaluation de la fonctionnalité des cellules différenciées est réalisée à travers plusieurs analyses. L'immunofluorescence est utilisée pour détecter l'expression du facteur de von Willebrand, un marqueur spécifique des cellules endothéliales. Les CSM sont ensemencées sur du collagène (témoin) ainsi que sur les polymères CHI/HA et CHI-SH/HA-Thio, sélectionnés pour leur biocompatibilité. Des contrôles négatifs sont inclus pour minimiser l'autofluorescence. La microscopie à fluorescence est utilisée pour visualiser et quantifier l’expression du marqueur. Le Western Blot est employé pour analyser l'expression de protéines endothéliales spécifiques. Des analyses protéiques ont été effectuées par Western Blot sur des CSM cultivées sur des films multicouches de polyélectrolytes. L'influence du pourcentage de SVF (stromal vascular fraction) (5% ou 2%) dans le milieu de différenciation (EGM-2) a été examinée, notamment son influence sur la formation de sphéroïdes tridimensionnels. Avec 5% de SVF, les CSM forment des sphéroïdes tridimensionnels sur PSS/PAH après 20 jours, avec un agrégat nucléaire. Avec 2% de SVF, les sphéroïdes n’apparaissent pas, et les cellules gardent leur morphologie fibroblastique. La cytométrie en flux est utilisée pour la caractérisation phénotypique des CSM. Le comportement des cellules est suivi pendant 20 jours par microscopie optique et immunofluorescence (DAPI).