Vitamine K et protéine Gas6 chez le rat

L'étude s'intéresse à l'effet de la vitamine K sur la carboxylation de la protéine Gas6, une protéine récemment découverte impliquée dans la régulation du cycle cellulaire. Bien que la vitamine K soit connue pour son rôle dans la coagulation sanguine via une réaction de γ-carboxylation essentielle à l'activation de plusieurs protéines, l'influence de la vitamine K sur la protéine Gas6 et son expression au cours du vieillissement restaient peu étudiés. L'objectif principal est donc de déterminer l'effet modulateur de la vitamine K sur la carboxylation de la protéine Gas6 à différents stades de la vie. Cette recherche s'avère importante car elle vise à combler les lacunes de connaissances concernant l'interaction entre la vitamine K, la protéine Gas6 et le processus de vieillissement, ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires impliqués et de leurs conséquences sur la santé.

L'étude utilise un modèle animal composé de rates Sprague-Dawley femelles âgées de 6 et 22 mois. Ces rates sont réparties en trois groupes recevant des régimes alimentaires contenant des niveaux variables de phylloquinone (forme de vitamine K1). L'analyse de la protéine Gas6 et de sa carboxylation est effectuée par immunobuvardage (Western blotting). Cette technique permet de détecter les formes carboxylées et non-carboxylées de la protéine Gas6 dans différents tissus. Le choix de l'immunobuvardage permet d'évaluer l'expression de la protéine Gas6 et, par conséquent, la mesure de l'impact de la vitamine K sur le processus de carboxylation. Cette approche quantitative permet de mesurer les niveaux d'expression de la forme carboxylée, offrant un indicateur de l'activité biologique de la protéine. La sélection des âges (6 et 22 mois) permet d'évaluer l'impact potentiel du vieillissement sur cette relation.

Les résultats montrent que les formes carboxylée et totale de la protéine Gas6 sont présentes dans tous les tissus étudiés chez les rates. Plus important encore, une corrélation positive significative est observée entre les taux d'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6 et les concentrations tissulaires de vitamine K, particulièrement la MK-4 (ménaquinone-4). L'analyse a révélé que l’apport en vitamine K, et plus spécifiquement en MK-4, influence positivement la quantité de protéine Gas6 carboxylée. Il est notable que le niveau d'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6, en fonction des concentrations tissulaires de vitamine K, ne soit pas influencé par l'âge des animaux, ce qui suggère que l'impact de la vitamine K sur la carboxylation de Gas6 est indépendant du vieillissement, au moins dans le cadre de cette étude et sur les paramètres étudiés.

En conclusion, cette étude démontre un effet modulateur clair de l'apport en vitamine K sur l'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6. La corrélation positive entre l'apport en vitamine K, notamment la MK-4, et les niveaux de la protéine Gas6 carboxylée confirme l'hypothèse de départ. L'absence d'impact de l'âge sur cette corrélation suggère que le mécanisme d'action de la vitamine K sur la carboxylation de la protéine Gas6 est constant à travers les différentes périodes de vie étudiées. Cette recherche contribue significativement à la compréhension du rôle de la vitamine K dans le métabolisme de la protéine Gas6 et souligne son importance pour l'activité biologique de cette protéine impliquée dans des processus cellulaires majeurs tels que la régulation du cycle cellulaire. Les résultats ouvrent des perspectives intéressantes pour des études plus approfondies.

La vitamine K, une vitamine liposoluble, est essentielle comme cofacteur dans la réaction de γ-carboxylation, transformant les résidus d'acide glutamique (Glu) en résidus d'acide γ-carboxyglutamique (Gla) dans plusieurs protéines. Cette modification post-traductionnelle est indispensable à l'activité biologique de ces protéines. Initialement reconnue pour son rôle crucial dans l'hémostase (coagulation sanguine), la vitamine K est maintenant impliquée dans d'autres processus biologiques, notamment la régulation du cycle cellulaire. L'importance d'un apport alimentaire suffisant en phylloquinone (K1) pour maintenir un statut nutritionnel adéquat en vitamine K a été démontrée chez l'homme et de nombreuses espèces animales. Plusieurs formes de vitamine K existent, dont la phylloquinone (K1), les ménaquinones (MK-n, avec n représentant la longueur de la chaîne isoprénique), et la ménadione (K3), une forme synthétique. La phylloquinone est la forme prédominante dans les végétaux, tandis que les ménaquinones sont présentes dans certains aliments fermentés et dans le foie.

L'efficacité de l'absorption de la vitamine K dépend de sa source alimentaire et de la présence de lipides dans l'intestin. L'absorption est plus élevée à partir de sa forme pure (environ 80% chez l'humain en bonne santé) comparativement à sa forme dans les légumes verts (environ 10%), où elle est liée aux chloroplastes. L'absorption est améliorée par la présence de matières grasses. La distribution tissulaire de la vitamine K varie en fonction de sa forme moléculaire. La phylloquinone et la MK-4 sont les deux formes principales dans les organes, avec des concentrations variables selon l'organe considéré. La phylloquinone est majoritairement retrouvée dans le foie, le cœur, le pancréas, les glandes salivaires et le cerveau, tandis que la MK-4, moins abondante dans le foie, est largement distribuée dans plusieurs organes, et particulièrement concentrée dans le cerveau (98% de la vitamine K totale). Des études précisent même une distribution régionale différente de la MK-4 dans le cerveau, avec des concentrations plus élevées dans la substance blanche que dans la matière grise.

L'âge affecte la concentration tissulaire de la vitamine K de manière différente selon la forme moléculaire. Chez le rat, les niveaux de MK-4 diminuent avec l'âge dans la plupart des tissus extrahépatiques, tandis que ceux de phylloquinone restent relativement stables, à l'exception d'une augmentation dans le foie. Chez l'humain, les études se limitent au compartiment plasmatique, où la concentration plasmatique de phylloquinone tend à augmenter avec l'âge. Plusieurs facteurs influencent la concentration tissulaire de la vitamine K, dont l'apport alimentaire, l'âge et le sexe. En général, les concentrations tissulaires augmentent en fonction des apports alimentaires. Par exemple, chez le rat, la teneur en phylloquinone dans les tissus est multipliée par 1,5 à 7 chez les animaux ayant reçu un régime enrichi en vitamine K comparé à un régime pauvre. Ces variations soulignent la complexité du métabolisme de la vitamine K et la nécessité de prendre en compte ces différents facteurs pour une interprétation précise des résultats.

La protéine Gas6 possède une structure tripartite, comprenant trois domaines distincts : un domaine Gla (pour γ-carboxyglutamique), un domaine EGF (pour epidermal growth factor), et un domaine SHBG (pour sex hormone-binding globulin). Le domaine Gla, situé à l’extrémité N-terminale de la protéine, contient de 11 à 12 résidus d’acide γ-carboxyglutamique (Gla). Ces résidus Gla, produits par une réaction de carboxylation vitamine K-dépendante, sont essentiels à l’activité biologique de la protéine Gas6. Ils augmentent son affinité pour les ions calcium (Ca2+), permettant ainsi sa liaison à la membrane cellulaire et plus précisément aux phospholipides, notamment les phosphatidylsérines. Le domaine EGF, quant à lui, est impliqué dans l'interaction avec d'autres protéines. Enfin, le domaine SHBG, localisé à l’extrémité C-terminale, est crucial pour la liaison de la protéine Gas6 à ses récepteurs membranaires, ce qui est primordial pour son activation et son rôle dans la régulation cellulaire. Des études utilisant des variantes de Gas6 ont confirmé l'importance du domaine SHBG pour la liaison aux récepteurs.

La protéine Gas6 est exprimée dans une variété de tissus chez le rat, notamment la peau, le poumon, l’aorte, le thymus, la rate, la moelle osseuse, les plaquettes sanguines et la paroi vasculaire. Des études d'immunohistochimie ont également révélé sa présence dans différentes régions du cerveau, incluant le bulbe olfactif, le cervelet, l’hippocampe, le cortex, le striatum et des structures hypothalamiques. Chez l’homme, la protéine Gas6 a été détectée dans le cartilage, le poumon, et à des niveaux plus faibles, dans le pancréas (îlots de Langerhans) et le rein. Il est important de noter que les niveaux d'expression de la protéine Gas6 peuvent varier en fonction de l'âge, notamment dans le cerveau où une diminution de l'expression a été observée au cours du vieillissement. Cependant, l’effet de l’âge sur l’expression de la protéine Gas6 dans d’autres organes reste à déterminer plus précisément.

La protéine Gas6 est impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, jouant un rôle important dans la prolifération, la différenciation et la mort cellulaire (apoptose). Son activité biologique requiert impérativement sa carboxylation ; des études ont démontré qu'une protéine Gas6 décarboxylée est beaucoup moins active, voire inactive. Gas6 favorise la prolifération de divers types cellulaires, notamment les cellules du muscle lisse vasculaire, les chondrocytes humains, les fibroblastes NIH 3T3 et les cellules mésangiales du glomérule. Son action mitogénique passe par la liaison à son récepteur Axl. De plus, Gas6 exerce une fonction anti-apoptotique, agissant via différentes voies de signalisation, dont la voie PI3K/Akt, jouant un rôle majeur dans la survie cellulaire. La voie JNK et la voie MEK/ERK peuvent également être impliquées, selon le type cellulaire. L'implication de Gas6 dans la coagulation sanguine a également été mise en avant, modulant l'agrégation plaquettaire et la stabilisation du thrombus.

L'étude a été menée sur des rates Sprague-Dawley femelles, obtenues chez Charles River Canada (St-Constant, QC). Âgées de 4 semaines au début de l'expérience et pesant entre 50 et 70 g, elles ont été réparties aléatoirement en trois groupes de 30 rates chacun. Chaque groupe a reçu un régime alimentaire différent en termes d'apport en phylloquinone (vitamine K1) : un régime faible (environ 90,7 µg/kg), un régime adéquat (environ 513,5 µg/kg, correspondant aux recommandations de l'American Institute of Nutrition pour le rat), et un régime enrichi (environ 2022,3 µg/kg), soit quatre fois la quantité du régime adéquat. La consommation alimentaire et le poids corporel ont été suivis toutes les deux semaines. Le choix de ces trois régimes a permis d'évaluer l'impact de différents niveaux d'apport en vitamine K sur l'expression et la carboxylation de la protéine Gas6, en couvrant un spectre allant d'un apport limité à un apport élevé.

La quantification de la vitamine K dans les tissus a été réalisée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Avant l'analyse, la vitamine K (sous sa forme quinone) a été réduite en hydroquinone pour la quantification par détection de fluorescence. Des standards de K1 et de MK-4 (ménaquinone-4), achetés chez Sigma Chemicals (St Louis, MO), ont été utilisés pour le calibrage. Tous les solvants (Fischer Scientific Canada, Nepean, ON) étaient de qualité HPLC. Le système HPLC comprenait un injecteur automatique (Waters, Mississauga, ON), une pompe (Waters) et un détecteur à fluorescence (Hitachi). Une colonne analytique C-18 a été utilisée. L'extraction lipidique des tissus impliquait une étape de broyage des échantillons, suivi de l'ajout d'un standard interne (dihydrophylloquinone, don du laboratoire de la Vitamine K, Jean Mayer, USDA Human Nutrition Research Center on Aging à Tufts University, Boston) et d'acétone. L'utilisation d'un standard interne a permis de corriger les variations de l'extraction et d'améliorer la précision des mesures. Le logiciel Millenium (Waters) a été employé pour l'analyse des données chromatographiques.

L'analyse de l'expression de la protéine Gas6 a été effectuée par immunobuvardage, utilisant deux anticorps : un anticorps anti-Gas6 (pour détecter la protéine totale) et un anticorps anti-Gla (pour détecter la forme carboxylée, car les résidus Gla sont le produit de la réaction de carboxylation). La quantité de protéines appliquées sur le gel a été optimisée pour une détection optimale de la protéine Gas6. Les tissus congelés des organes ont été homogénéisés et la concentration protéique a été mesurée par la méthode de Bradford (BioRad, Mississauga, ON). Avant la séparation par électrophorèse, des échantillons de 50 µg de protéines ont été incubés avec une solution tampon spécifique. L'étude a été réalisée en triplicata pour chaque groupe d'âge et chaque régime alimentaire afin d'assurer la reproductibilité des résultats. Les résultats densitométriques ont été normalisés en utilisant le groupe adéquat comme référence afin de comparer les résultats entre les différents gels.

L'effet de l'apport en K1 sur les taux d'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6 a été analysé en comparant les données densitométriques des groupes recevant des régimes faibles, adéquats et enrichis en K1. Étant donné les limitations liées à la comparaison directe de données provenant de gels différents, une transformation des données a été effectuée, utilisant le groupe adéquat comme référence. Des corrélations semi-logarithmiques ont ensuite été établies entre les taux d'expression relative de la protéine Gas6 carboxylée et les concentrations tissulaires de vitamine K totale, MK-4 et K1, séparément pour les groupes de 6 mois et 22 mois. Une ANOVA factorielle a été utilisée pour évaluer l'effet significatif de l'âge sur la relation entre l'expression de la forme carboxylée de Gas6 et la concentration tissulaire en vitamine K.

Les résultats de l'étude confirment l'hypothèse principale : les niveaux d'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6 varient en fonction de l'apport en vitamine K. Une corrélation positive est observée entre les taux d'expression de la forme carboxylée de Gas6 et les concentrations tissulaires de vitamine K, plus particulièrement de MK-4. Cette étude est la première, à la connaissance des auteurs, à démontrer un tel effet de l'apport alimentaire de vitamine K sur les niveaux de la forme active de la protéine Gas6. Il est important de souligner que l'impact de la vitamine K sur la carboxylation des protéines a déjà été étudié pour d'autres protéines, comme l'ostéocalcine, mais cette étude apporte des données nouvelles sur la protéine Gas6. L'absence de corrélation entre l'expression de la protéine Gas6 totale et les niveaux tissulaires de vitamine K suggère que l'effet de la vitamine K est spécifique à la réaction de carboxylation et non à la synthèse de la protéine elle-même.

Contrairement à l'hypothèse initiale, l'âge des animaux (6 vs 22 mois) n'a pas d'impact significatif sur la relation entre l'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6 et les concentrations tissulaires de vitamine K. Ceci diffère de certains résultats rapportés dans la littérature concernant la concentration tissulaire de MK-4 en fonction de l'âge chez le rat, où une diminution dans certains tissus a été observée. Ces divergences pourraient s'expliquer par des différences méthodologiques ou des variations liées aux souches d'animaux utilisés. Néanmoins, les résultats de cette étude indiquent une modulation de l'expression de la forme carboxylée de Gas6 par la vitamine K, indépendamment de l'âge des animaux au cours des phases étudiées. Ces données nécessitent une confirmation avec des échantillons de taille supérieure.

Les résultats de cette étude indiquent que l'expression de la forme carboxylée de la protéine Gas6 est modulée spécifiquement par la vitamine K tissulaire, principalement par la MK-4. L'expression de la forme totale de la protéine n'est pas affectée, confirmant un effet spécifique sur la carboxylation. Ces résultats sont cohérents avec ceux rapportés pour l'ostéocalcine, suggérant un mécanisme d'action commun pour les protéines dépendantes de la vitamine K. Les futures recherches pourraient se concentrer sur l'impact de la vitamine K sur l'action de la protéine Gas6 dans des modèles de désordres du cycle cellulaire, comme les modèles de néoplasie, afin d'explorer le potentiel thérapeutique de la vitamine K et ses implications pour le traitement ou la prévention des maladies associées au vieillissement. La petite taille des groupes étudiés représente une limitation et des études avec des échantillons plus grands seraient souhaitables pour augmenter la puissance statistique.