Régulation de la synthèse des protéoglycanes et du phénotype chondrocytaire

L'étude débute par l'observation clé d'une régulation biphasique de l'expression du gène de la xylosyltransférase I (XT-I) par l'interleukine-1β (IL-1β) dans les chondrocytes humains. Une augmentation significative de l'expression de l'ARNm XT-I est observée après 6 et 12 heures de traitement à l'IL-1β (respectivement 1,8 et 3 fois l'expression de base). Cependant, une diminution de 50% de l'expression est constatée après 24 heures. Cette régulation biphasique, une phase d'induction précoce suivie d'une phase d'inhibition tardive, est également observée pour l'agrécane, suggérant une régulation coordonnée par des mécanismes similaires. Cette découverte initiale met en évidence un rôle complexe et dynamique de l'IL-1β dans la régulation de la synthèse des protéoglycanes, impliquant potentiellement une réponse cellulaire initiale de compensation suivie d'une inhibition plus durable. La compréhension de ce mécanisme est cruciale pour saisir les processus de dégradation du cartilage dans l'arthrose.

Pour approfondir la compréhension du mécanisme de régulation biphasique, l'étude s'est focalisée sur l'analyse du promoteur du gène XT-I. Le clonage et l'expression du promoteur XT-I dans des chondrocytes humains ont permis d'identifier des éléments clés de réponse impliqués dans l'activité promotrice constitutive et régulée par l'IL-1β. L'analyse par délétion du promoteur a déterminé qu'une région d'environ -850 pb est essentielle à cette activité. Des analyses de mutations ponctuelles et des études de signalisation ont ensuite révélé que l'activité du promoteur induite par l'IL-1β s'effectue via des éléments de réponse AP-1 et est médiée par les voies de signalisation SAP/JNK et p38. Ces résultats précisent le mécanisme moléculaire sous-jacent à la régulation de l'expression de XT-I par l'IL-1β, en mettant en évidence des éléments cis-régulateurs et des voies de signalisation trans-régulateurs spécifiques.

L'étude a ensuite exploré le rôle spécifique des facteurs de transcription AP-1 et Sp3 dans la régulation de l'expression de XT-I. Des expériences de transactivation et d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ont démontré qu'AP-1 est un puissant activateur du promoteur XT-I, son recrutement au promoteur étant accru suite à un traitement à l'IL-1β. Ces résultats corroborent le rôle central de la voie AP-1 dans la phase d'induction précoce de l'expression de XT-I. À l'inverse, le facteur Sp3 agit comme un répresseur de l'activité du promoteur XT-I. Des analyses de pulldown ont montré un recrutement accru de Sp3 à un site de liaison Sp1 (-125) après un traitement prolongé à l'IL-1β (24 heures). Cette liaison de Sp3 expliquerait probablement la phase d'inhibition tardive de l'expression de XT-I. La modulation de l'équilibre entre AP-1 et Sp3 semble donc être un élément clé de la régulation de la synthèse des protéoglycanes.

L'implication des voies de signalisation SAP/JNK et p38 dans l'activation du promoteur XT-I induite par l'IL-1β a été confirmée par l'utilisation d'inhibiteurs spécifiques. La phosphorylation de ces kinases, observée après traitement à l'IL-1β, soutient leur rôle dans cette activation. De plus, un test MTT a montré que les inhibiteurs de JNK, p38 et Sp1 n'affectent pas de manière significative la viabilité des chondrocytes, validant l'effet spécifique sur les voies de signalisation. L'activation du promoteur XT-I par la voie p38 est probablement due à la phosphorylation de c-Fos, ce qui suggère une action conjointe avec l'activation de c-Jun par JNK. Ces résultats confirment le rôle central des voies de signalisation MAPK dans la régulation de l'expression du gène XT-I en réponse à l'IL-1β. L'identification de XT-I comme cible de la voie de signalisation IL-1β et le rôle crucial d'AP-1 dans l'induction et de Sp3 dans la répression de l'expression de XT-I ouvrent de nouvelles perspectives thérapeutiques.

L'étude pose l'hypothèse que le dysfonctionnement de la voie Wnt contribue à la pathologie du cartilage, notamment dans l'arthrose et la polyarthrite rhumatoïde. L'expression des composants de la voie Wnt a été observée dans ces pathologies articulaires. Plusieurs études identifient FRZB, un antagoniste de Wnt, comme gène candidat associé à un risque accru d'arthrose, un polymorphisme spécifique (R324G) étant corrélé à un risque plus élevé chez les femmes. De même, des taux circulants élevés de DKK-1, un autre antagoniste de Wnt, sont suggérés comme étant corrélés à une progression réduite de l'arthrose de la hanche chez les femmes âgées. Ces observations soulignent la complexité de la régulation de la voie Wnt et son implication dans les mécanismes de dégénérescence du cartilage.

L'étude se concentre sur l'impact de Wnt-3a sur l'expression de protéines clés du cartilage. Il est démontré que Wnt-3a inhibe l'expression du protéoglycane syndécan 4 (SDC4) dans le cartilage humain et les chondrocytes en culture via la voie de signalisation non canonique ERK1/2. L'inhibition de l'expression du collagène II par Wnt-3a est également mise en évidence et semble être médiée par le syndécan 4. L'étude suggère que le syndécan 4 joue un rôle essentiel dans l'activation des voies non canoniques par Wnt-3a, probablement via une interaction avec la protéine régulatrice Dishevelled. Ces résultats précisent le mécanisme d'action de Wnt-3a sur des composants structuraux importants du cartilage, soulignant son influence sur l'homéostasie du tissu.

Une autre facette de l'implication de la voie Wnt dans la dégénérescence du cartilage est explorée en examinant l'effet de Wnt-3a sur la dégradation de la matrice extracellulaire. L'étude montre que Wnt-3a atténue les effets délétères de l'IL-1β sur les protéoglycanes et le collagène II en inhibant l'expression des enzymes dégradatives ADMTS4 et MMP13. Ceci suggère que Wnt-3a pourrait moduler la balance entre anabolisme et catabolisme du cartilage, offrant une perspective thérapeutique intéressante. La réduction de l'expression des MMPs et ADAMTS4 par Wnt-3a suggère un potentiel protecteur contre la dégradation enzymatique de la matrice extracellulaire, contribuant ainsi au maintien de l'intégrité du cartilage.

Les chondrocytes utilisés dans cette étude proviennent d'échantillons de cartilage prélevés sur des genoux de 13 patients (âge moyen 65 ± 9 ans) subissant un remplacement total du genou. L'étude a été approuvée par la Commission de la Recherche Clinique (numéro d'enregistrement UF 9757, CPRC 2004). L'isolement des chondrocytes s'effectue par digestion enzymatique séquentielle, impliquant une incubation avec de la pronase puis de la collagénase B. Les cellules sont ensuite mises en culture en monocouche pendant 10 à 12 jours (stade P0), puis subissent un passage (stade P1). Seuls huit des treize échantillons de chondrocytes se sont avérés répondeurs aux cytokines IL-1 et TGF, et trois cultures ont été sélectionnées pour les expériences ultérieures. Le protocole est conforme aux directives éthiques de la Déclaration d'Helsinki, avec le consentement éclairé écrit de chaque patient. Les cellules sont maintenues dans un milieu DMEM-F12 supplémenté avec de la glutamine, de la streptomycine, de la pénicilline et du sérum de veau foetal (Invitrogen).

L'étude utilise diverses techniques de biologie moléculaire. La PCR quantitative en temps réel (RT-qPCR) est employée pour mesurer l'expression des gènes XT-I, agrécane, SOX9, COL2A1, COL1A1, et de la protéine ribosomale S29 (contrôle interne). Le kit RNeasy (Qiagen) est utilisé pour l'extraction de l'ARN total, et le kit SuperScript Reverse Transcriptase (Clontech) pour la synthèse d'ADNc. L'amplification par PCR utilise le SYBR Green Master Mix (Qiagen) et un système de détection LightCycler (Roche Applied Science). La spécificité de l'amplification est vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose. Des analyses de transfection sont réalisées en utilisant des constructions du promoteur XT-I et le vecteur pRL-TK (Promega) comme témoin de transfection, avec Exgen 500 (Euromedex) comme agent de transfection. L'activité luciférase est mesurée avec le système Dual-Luciferase Assay System (Promega) et un luminomètre Berthold. Différents fournisseurs de réactifs sont mentionnés: New England Biolabs, Sigma, Promega, Qiagen, Invitrogen, Active Motif, MWG-Biotech et Stratagène.

L'analyse de l'expression protéique est effectuée par Western Blot. Les protéines sont séparées par électrophorèse sur gel SDS-PAGE selon la méthode de Laemmli, puis transférées sur une membrane PVDF (Millipore). L'immunodétection utilise des anticorps primaires dirigés contre diverses protéines (p44/42 MAPK, phospho-p44/42, MAPK p38, phospho-p38, MEK1/2, phospho-MEK1/2, SAPK/JNK, phospho-SAPK/JNK, c-Jun, phospho-c-jun, Sp1, Sp3), fournis par Cell Signaling et Santa Cruz Biotechnology. La β-actine sert de contrôle de charge. L'immunoprécipitation est réalisée avec des billes magnétiques portant la protéine G et des anticorps anti-c-Jun ou des immunoglobulines contrôles. Le pull-down utilise des sondes biotinylées spécifiques (Sp1-125, SP1-40, AP1-640) pour la précipitation des protéines nucléaires. Un kit d'extraction nucléaire (Active Motif) est utilisé pour l'isolement des protéines nucléaires. Des techniques comme le test MTT ont été également utilisées pour l'évaluation de la cytotoxicité potentielle des inhibiteurs.